α-L-鼠李糖苷酶（E.C.3.2.1.40）是一种能特异性水解α-1，2、α-1，3、α-1，4、α-1，6和α-1鼠李糖苷键的水解酶，广泛存在于植物、动物和微生物中。

α-L-鼠李糖苷酶作为一种重要的糖苷水解酶，可应用于橘汁类饮料的脱苦、葡萄酒的增香以及催化含鼠李糖基的天然产物以提高其生物活性。在生物催化含鼠李糖基的天然产物中，高温α-L-鼠李糖苷酶的催化转化效率、反应体系的底物浓度明显高于常温α-L-鼠李糖苷酶。

·由于游离酶不能重复利用，导致酶的使用成本较高，很大程度上限制了工业应用。

·另一方面酶在实际应用过程中受反应体系的温度和pH的影响容易失活，继而影响了酶的催化效率。

酶的固定化

酶的固定化是一种节约酶的使用成本的有效手段，其能使酶在工业应用中被重复利用，且在一定程度上能够提高酶的稳定性。常见固定化酶的方法有共价结合、吸附、交联和包埋等，也可分为载体固定化和无载体固定化。其中，无载体固定化酶技术中的交联酶聚集体（cross-linkedebzymeaggregates，CLEAs）技术应用较广，该法不需要载体，而且对酶的纯度要求低、操作简便、酶回收率高。添加聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物F（PluronicF）制备交联酶聚集体是一种提高固定化酶稳定性和催化效率的有效方法，其可通过聚合物的疏水段与酶表面疏水区的相互作用提高酶的稳定性和活性。因此，PluronicF可用于交联酶聚集体的制备。

南京林业大学许锦，赵林果等在前期研究中克隆表达了来源ThermotogapetrophilaDSM的GH78家族的耐高温的α-L-鼠李糖苷酶（TpeRha），该酶能够有效催化多种黄酮类底物（淫羊藿苷、朝霍定Ｃ等），但该酶存在高温条件下稳定性较差、酶使用成本高等缺点。

因此，本课题研究了添加共聚物PluronicF制备α-L-鼠李糖苷酶交酶聚集体的方法，并将固定化酶（PAG-R）应用于芦丁的转化，旨在将固定化酶和高温酶的优势有机结合起来，改善高温α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质，提高酶的催化性能和重复利用率。研究结果为α-L-鼠李糖苷酶在含鼠李糖基的天然产物中的规模化应用提供技术支撑。

１　材料与方法

1.1　试验材料与试剂

1.2　主要仪器与设备

1.3　试验方法

1.3.1　游离酶的制备

1.3.2　固定化酶的制备

1.3.3　酶活力的测定

1.3.4　蛋白含量的测定

1.3.5　固定化酶制备条件优化

1.3.6　固定化酶的酶学性质

1.3.7HPIC分析

1.3.8PAG-R转化芦丁

1.4　数据分析

2　结果与分析

2.1　固定化酶的条件

2.1.1　酶蛋白与PluronicF的质量比

在固定化酶的过程中加入不同质量的PluronicF处理，对固定化酶的酶活回收率有很大的影响，结果如图1a所示。不加PluronicF处理的固定化酶酶活力为10U/mL，酶活回收率仅为17.00％，而随着加入PluronicF质量的增加，固定化酶酶活力和酶活回收率会逐渐提高，在酶蛋白与PluronicF的质量比为1∶8时，固定化酶酶活力为20U/mL，回收率达到36.52％；这是由于PluronicF的疏水段与酶表面疏水区的相互作用逐渐增强，酶的稳定性逐渐提高；但当达到一定程度后，相互作用力过大会影响酶的结构的稳定，从而使其酶活降低。因此，最佳酶蛋白与PluronicF的质量比为1∶８。

2.1.2　硫酸铵质量浓度

加入沉淀剂的作用是改变溶液的静电参数，破坏酶蛋白分子内的非共价键，使其空间结构变形，从而聚集形成沉淀。在一定浓度内，随着沉淀剂的浓度越高，酶蛋白沉淀越快，其空间结构改变一定程度上会较小，从而对其酶活性中心的破坏越小；当浓度过高时，会导致酶空间结构包括活性中心变形，影响其酶活力，这与图1b结果符合。因此，最佳硫酸铵质量浓度为75mg/mL。

2.1.3　戊二醛浓度

在无载体的固定化酶?交联酶聚集体制备过程中，戊二醛两端的醛基官能团能够与酶蛋白上的多种官能团共价结合，并形成聚集体。当戊二醛的浓度过小时，交联不充分导致部分酶蛋白脱落，暴露在环境中容易失活；而戊二醛的浓度过高时，会导致酶蛋白活性中心构象改变而失活。因此，最佳戊二醛的浓度如图1c所示，为40mmol/L。

2.1.4　固定顺序

探究了试剂处理顺序对固定化酶的影响，结果如图1d所示。常用的交联酶聚集体CLEA的制备顺序所制备的固定化酶的酶活回收率为30.85％，而先加入PluronicF对酶蛋白进行处理，所制备的固定化酶的酶活回收率为60.90％，是前者的1.97倍，此时固定化酶酶活力可达到34U/mL。这可能是由于PluronicF的疏水片段与酶的疏水片段相互作用，保证了酶蛋白在沉淀剂沉淀作用下的酶活损失少。

2.2PAG-R的酶学性质

2.2.1　最适温度和最适pH

固定化酶的最适温度及最适pH如图2a、b所示。PAG-R的最适温度为90℃、最适pH为5.0，较游离酶差别不大。PAG-R的反应温度和pH范围较游离酶均有所扩宽，在其他不同温度和V条件下，PAG-R的相对酶活亦明显高于游离酶。

2.2.2　温度稳定性和pH稳定性

PAG-R、TpeRha的温度稳定性和pH稳定性如图2c、d所示。在不同温度保温3h后，PAG-R和TpeRha的相对酶活力相差很大，TpeRha在90，95℃保温后，酶活力完全丧失，而PAG-R的相对酶活仍有77.13％和54.12％，说明固定化后酶的热稳定性显著提高。另一方面，PAG-R在pH6.0～8.0条件下、70℃保温3h，PAG-R的相对酶活仍保持在72.41％以上，是TpeRha的3倍左右。说明固定化后不仅酶的热稳定性显著提高，酶的pH稳定性也得到了极大的改善，可能是由于固定化酶具有更加稳定的空间立体结构，酶蛋白耐受热变性的能力提高。

2.2.3　鼠李糖耐受性

α-L-鼠李糖苷酶在底物的水解过程中，通常被水解产物所抑制。固定化酶技术有望能改善其糖耐受性。在相同条件下分别研究游离酶和固定化酶对鼠李糖的耐受性，结果如图３所示。TpeRha随着鼠李糖浓度逐渐升高，相对酶活下降非常迅速，鼠李糖浓度为5mmol/L时，其相对酶活仅为29.21％，说明TpeRha对鼠李糖极不耐受，导致其在实际应用中催化效果不佳。而PAG-R在相同鼠李糖浓度下，相对酶活为65.50％，比游离酶高36.29％，有效提高了该酶的鼠李糖的耐受性。分析原因可能是固定化后，酶蛋白的空间结构发生改变，鼠李糖苷酶的催化通道内，与鼠李糖结合的非催化位点变多，降低了其与催化活性位点结合的几率，从而提高了鼠李糖苷酶的糖耐受性，这与Yoshida等研究的葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性结果相似。

2.2.4　动力学参数测定

根据米氏方程计算得出TpeRha和PAG-R的动力学参数，结果如表1所示。由表1可见，PAG-R和TpeRha的Vmax值相近，Km值分别为5.77和4.66mmol/L，这与Wu等发现的多形拟杆菌来源的鼠李糖苷酶BtRha的Km值相近，且固定化酶对底物pNPR的亲和力略大于游离酶。

2.3PAG-R催化芦丁转化的应用

2.3.1　最适温度和最适pH

PAG-R催化芦丁转化生成异槲皮素过程中，温度在65～80℃时，随温度的升高异槲皮素产率逐渐提高（图4a），80～90℃时达到平衡，PAG-R在此温度下的催化效果相同，但在95℃产率有所下降，可能是由于95℃时酶活力有所下降导致。根据PAG-R的温度和pH稳定性检测结果，选择80℃为转化最适温度，pH6.0为转化的最适pH（图4B）。

2.3.2　加酶量优化

加酶量对异槲皮素产率的影响结果如图4c所示。转化率随酶量的增加而逐渐升高，加酶量为4～12U/mL时产率均达到％。结合用酶成本，选择4U/mL为转化时的最佳加酶量。

2.3.3　底物浓度与转化时间的关系

以4U/mL的酶量分别转化3和4g/L的底物，转化随时间的变化如图4d所示。由图4d可见，3g/L的底物在90min时异槲皮素产率到％，4g/L的底物在min时异槲皮素产率到95.88％。结合图4c，1g/L的底物在30min时异槲皮素产率达到％，说明PAG-R催化芦丁转化的能力在一定底物浓度范围不受底物和产物的影响，也与鼠李糖耐受性的研究结果相符合。

2.3.4PAG-R与游离酶催化效果的比较

分别以4U/mL的PAG-R和游离酶TpeRha转化3g/L的芦丁，结果如图5所示。PAG-R和TpeRha催化芦丁的转化量均随着时间的延长而逐渐增加，但在相同的反应时间内，PAG-R催化芦丁生成异槲皮素的产率显著高于TpeRha。转化90min时，PAG-R生成异槲皮素的产率％，TpeRha的异槲皮素产率43.36％，PAG-R催化异槲皮素的生成量是TpeRha的2.31倍。这是由于PAG-R在80℃和pH6.0条件下的稳定性较游离酶TpeRha高很多，综合图2c、d可知，固定化后的PAG-TpeRha在80℃和pH6.0条件下保温3h后，剩余酶活力均达到85％以上，而游离酶TpeRha在80℃和pH6.0条件下极不稳定，这是导致两者催化效果差距大的主要原因。另一方面，随着催化反应的进行，反应体系中的产物鼠李糖的含量不断增加，游离酶的产物反馈抑制作用比PAG-R更严重，导致其催化活力下降。

2.3.5　重复使用次数

游离酶的不可重复使用性是限制其在工业应用的最重要因素之一，利用固定化酶技术提高酶的重复利用率是减少酶使用成本的重要途径。以4U/mLPAG-R、3g/L芦丁反应90min为一个循环，重复反应10次后，相对转化率保持在60％以上（图6），这有利于嗜热α-L-鼠李糖苷酶的工业应用。

结论

１）固定化酶（PAG-R）制备适宜条件为：酶蛋白与PluronicF质量比为1∶8、沉淀剂硫酸铵质量浓度为75mg/mL、戊二醛浓度为40mmol/L、固定顺序为PluronicF硫酸铵-戊二醛；酶活回收率最高达到60.90％，酶活力为34U/mL。

２）固定化酶的最适温度和pH与游离酶相近，反应温度和pH范围较游离酶均有所扩宽；固定化后酶的温度稳定性、pH稳定性和鼠李糖耐受性均显著提高。

３）固定化酶（PAG-R）转化芦丁的最适条件为：80℃、pH6.0、加酶量4U/mL；在相同条件下转化芦丁，PAG-R催化异槲皮素的生成量是TpeRha的2.31倍；且重复使用10次后，相对转化率仍达到60％以上。研究结果为来自嗜热菌T.petrophilaDSM耐高温GH78家族的α-L-鼠李糖苷酶应用于催化淫羊藿苷、朝霍定C等溶解性差的黄酮化合物转化提供了技术支持。