1范围

本方法规定了保健食品中槲皮素、山柰素、异鼠李素的液相色谱测定方法。

本方法适用于以银杏叶或银杏叶提取物为主要原料的保健品食品中槲皮素、山柰素、异鼠李素的测定。

2原理

试样经提取、水解等前处理后，采用液相色谱分离、紫外检测器检测，以保留时间定性，以外标法定量。

3试剂和材料

注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T规定的一级水。

3.1试剂

3.1.1甲醇(CH3OH)：色谱纯。

3.1.2磷酸(H3PO4)。

3.1.3盐酸(HCl)：质量分数约37%。

3.2试剂配制

3.2.1盐酸溶液(1.5mol/L)：取盐酸13.5mL，加水适量使成mL，摇匀。

3.2.%甲醇溶液：将甲醇和水按80+20的体积比混合均匀。

3.3标准品

3.3.1槲皮素(C15H10O7)：CAS编号-39-5，纯度≥98%。

3.3.2山柰素(C15H10O6)：CAS编号-18-3，纯度≥98%。

3.3.3异鼠李素(C16H12O7)：CAS编号-19-3，纯度≥98%。

3.3标准溶液的配制

3.4.1标准储备液(1mg/mL)：分别准确称取槲皮素、山柰素、异鼠李素标准品mg(准确至0.1mg)，于mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度。

3.4.2槲皮素、山柰素、异鼠李素混合标准中间液(μg/mL)：分别准确吸取槲皮素、山柰素、异鼠李素标准储备液各5.00mL于25mL容量瓶中，用流动相定容。

3.4.3混合标准系列工作液：分别准确吸取槲皮素、山柰素、异鼠李素混合标准中间液0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL和5.00mL于10mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，配制成质量浓度分别为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、μg/mL的混合标准系列工作液。

4仪器设备

4.1高效液相色谱仪：附二极管阵列或紫外检测器（UV）。

4.2分析天平：感量为1mg和0.1mg。

4.3超声波清洗器：功率≥W。

4.4水浴锅。

5分析步骤

5.1试样制备

5.1.1槲皮素、山柰素、异鼠李素的测定

取试样适量（相当于含槲皮素、山柰素、异鼠李素总量约3mg，精确至0.g），加20mL甲醇，超声提取30min，滤过，残渣用甲醇约5mL洗涤，洗液并入滤液，加入20mL盐酸溶液(1.5mol/L)，水浴回流水解3h，冷却，转移至50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，作为试样待测液。

5.1.2游离槲皮素、山柰素、异鼠李素的测定

取试样适量（相当于含槲皮素、山柰素、异鼠李素总量约3mg，精确至0.g），置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇溶液20mL，密塞，称定重量，超声提取（功率W，频率33kHz）20min，取出，放冷，再称定重量，用80%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为试样待测液。

5.2色谱参考条件

5.2.1色谱柱：C18柱，5μm，，3.9mmID×mm或同等性能色谱柱。

5.2.2柱温：室温。

5.2.3检测波长：nm。

5.2.4流动相：甲醇+0.4%磷酸溶液=50+50。

5.2.5流速：1.0mL/min。

5.2.6进样量：10μL。

5.3标准曲线的制作

将10μL的混合标准系列工作液分别注入液相色谱仪中，测得相应的峰面积，以标准工作液的浓度(μg/mL)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

5.4试验溶液的测定

将10μL试样待测液(5.1.1)注入液相色谱仪中，以保留时间定性，测得峰面积，根据标准曲线得到待测液中槲皮素、山柰素、异鼠李素的浓度(μg/mL)；将10μL试样待测液(5.1.2)注入液相色谱仪中，以保留时间定性，测得峰面积，根据标准曲线得到待测液中游离槲皮素、山柰素、异鼠李素的浓度(μg/mL)。

6分析结果的表述

6.1试样中槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量分别按式(1)计算：

………………(1)

式中：

Xi——试样中槲皮素或山柰素或异鼠李素的含量，单位为克每百克(g/g)；

Ci——被测定样液中槲皮素或山柰素或异鼠李素的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

V——被测定样液的最终定容体积，单位为毫升(mL)；

m——试样的称样质量，单位为克(g)；

——单位转换；

0——单位转换。

6.2试样中槲皮素、山柰素、异鼠李素的总含量按式(2)计算：

………………(2)

式中：

X——试样中槲皮素、山柰素、异鼠李素的总含量，单位为克每百克(g/g)；

X1——试样中槲皮素的含量，单位为克每百克(g/g)；

X2——试样中山柰素的含量，单位为克每百克(g/g)；

X3——试样中异鼠李素的含量，单位为克每百克(g/g)。

6.3试样中银杏叶总黄酮醇苷的含量按式(3)计算：

………………(3)

式中：

Y——试样中银杏叶总黄酮醇苷的含量，单位为克每百克(g/g)；

X——试样中槲皮素、山柰素、异鼠李素的总含量，单位为克每百克(g/g)；

2.51——换算因子。

6.4试样中游离槲皮素、山柰素、异鼠李素的含量分别按式(4)计算：

………………(4)

式中：

Xi——试样中游离槲皮素或游离山柰素或游离异鼠李素的含量，单位为毫克每克(mg/g)；

Ci——被测定样液中游离槲皮素或游离山柰素或游离异鼠李素的浓度，单位为微克每毫升(μg/mL)；

V——被测定样液的最终定容体积，单位为毫升(mL)；

m——试样的称样质量，单位为克(g)；

0——单位转换。

计算结果以重复条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，保留三位有效数字。

7精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的10%。

8其他

当称样量为0.5g，定容体积为50mL时，本方法检测限分别为：槲皮素0.02mg/g、山柰素0.03mg/g、异鼠李素0.05mg/g。